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3
n
Biotin
=
ಳ
ெ
ಳ
=
ଵ
షల
ଶସସ,ଷଵ
ൌ
4,09 nmol
ฺ
ೄೝ
.
ಳ
ൌ
ଽଽଶ
כ
ଵ
షభమ
ସ,ଽ
כ
ଵ
షవ
݈݉ ൎ
ଵ
ସ
Da ein Streptavidinmolekül vier Biotinmoleküle binden kann, ist die Stoffmenge von Streptavidin
ଵ
ସ
so
groß wie die Stoffmenge von Biotin. Es zeigt sich, dass die Angaben (
15 ܷ ൌ 1 ݉݃
(
1 ܷ ൌ
ଵ
ଵହ
݉݃
)
und 1 Unit (U) Streptavidin bindet 1 µg Biotin) stimmen.
Für meine Messungen habe ich ½, 1 und 2 mg Streptavidin in jeweils 10 ml dest. Wasser gelöst.
Dadurch lassen sich die Konzentrationen der drei Stammlösungen berechnen:
c =
; V = 0,75 cm³
c
Strep.0,5
=
ೄೝ.బ,ఱ
ൌ
,ସସ
כ
ଵ
షవ
ଵ
య
ൌ 744
య
c
Strep.1
=
ೄೝ.భ
ൌ
ଵ,ସଽ
כ
ଵ
షఴ
ଵ
య
ൌ 1490
య
c
Strep.2
=
ೄೝ.మ
ൌ
ଶ,ଽ
כ
ଵ
షఴ
ଵ
య
ൌ 2970
య
Weiterhin habe ich 1 mg Biotin in 1 l dest. Wasser gelöst. Da nun aber zu berücksichtigen ist, dass das
Biotin mit einem fluoreszierenden Rest markiert ist, erhöht sich die Molmasse auf M
Biotin´
= 962
(Q4).
c
Biotin´
=
ಳ´
ൌ
ଵଽଷ
כ
ଵ
షవ
ଵ
ௗ
య
ൌ 1093
ௗ
య
Aufgrund der Größe der Küvette entnehme ich den Lösungen 2,5 ml Biotin und 0,75 ml Streptavidin:
c
Biotin´
כ
0,0025 ݀݉
ଷ
ൌ 2,6 ݈݊݉
c
Strep.1
כ
0,75 ܿ݉
ଷ
ൌ 1117,5 ݈݉
2,6
1117,5
כ
10
ିଷ
݈݊݉
݈݊݉
ൌ 2,33
Es zeigt sich, dass eine Konzentration von c
Biotin´
, bei erwähnter Entnahme der Lösung, das 2,33-fache
der Konzentration von c
Strep.1
ist. Bedenkt man nun, dass ein Streptavidinmolekül vier Biotinmoleküle
binden kann, müssten bei diesem Konzentrationsverhältnis alle Biotinmoleküle gebunden sein.
2. Wie messe ich die Reaktion?
I. Biotin mit Fluoreszenzrest
Biotin kann lokalisiert werden, indem es gelabelt wird. In diesem Fall ist es mit einem
Fluoreszenzrest markiert. Kommt es nun zu einer Bindung des gelabelten Biotins an das
Streptavidin, so geht ein Großteil der Fluoreszenz verloren, da der Fluoreszenzrest die
Oberfläche des Streptavidins berührt (Q6). Aus diesem Grund kann die Fluoreszenzintensität
als Maß an freien Biotinmolekülen gemessen werden, denn gebundenes Biotin fluoresziert
kaum.
II. Was ist Fluoreszenz?
Unter Fluoreszenz versteht man eine besondere Art der spontanen Emission von Photonen.
Elektronen absorbieren die Energie des Lichts und wandern auf ein höheres Energieniveau,
wenn die Energie einen bestimmten Wert hat (abhängig vom Molekül). In diesem Zustand