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10. Abschätzen systematischer Fehler
Um den systematischen Fehler abschätzen zu können werden alle Komponenten, die Einfluss
auf den Versuch nehmen können, auf ein Photonensignal überprüft:
•
Nullrauschen der APD
•
Küvette ohne Inhalt
•
Küvette mit dest. Wasser
•
Küvette nur mit Streptavidin
Es zeigt sich, dass das Nullrauschen der APD bei 16 Photonen pro Minute liegt und sowohl
eine leere Küvette, als auch eine Küvette mit dest. Wasser und reinem Streptavidin gefüllt
keine Fluoreszenz zeigt. Daher scheiden die 4 oben genannten Möglichkeiten als
systematische Fehler aus.
11. Fazit und Ausblick
Einige Charaktereigenschaften konnten weitgehend eingeschränkt werden. So konnte ich
feststellen, dass Streptavidin schon bei relativ niedriger Temperatur mit 30 °C-40 °C anfängt
zu denaturieren. Weiterhin spielen höhere Temperaturen eine entscheidende Rolle, da mit
steigender Temperatur die Wahrscheinlichkeit stetig sinkt, einen Biotin-Streptavidin-
Komplex vorzufinden. Der Einfluss der Konzentration an Streptavidin ist noch nicht eindeutig
feststellbar. Fakt ist, dass eine Veränderung dieser Konzentration einen Einfluss nimmt,
entweder auf die Anzahl gebundener Biotinmoleküle oder auf die Fluoreszenz selbst. Das
Verhalten für eine stetig sinkende Konzentration an Streptavidin muss weiter untersucht
werden. Dort ist zu erwarten, dass mit sinkender Anzahl an Streptavidinmolekülen die
Fluoreszenzintensität zunimmt, da die Anzahl an freien Biotinmolekülen steigt. Geht man
jedoch von dem derzeitigen Stand der Messungen aus, so müsste die Fluoreszenzintensität
weiter sinken, wenn Streptavidin fluoreszenzfördernd wirkt. Weiterhin möchte ich nun auch
eine Messreihe mit Avidin machen, obwohl es zu Nebenreaktionen neigt, da es ein
Glykoprotein ist. Dennoch werde ich damit das biophysikalische Praktikum der Uni Linz (Q6)
simulieren (bis auf das Verfolgen der Reaktion „in real time“). Falls dies andere Ergebnisse
ergibt, so zeigt sich ein Unterschied zwischen Avidin und Streptavidin bezüglich der Reaktion
mit Biotin.
12. Übertragung auf Forschung im Organismus
Die Immunhistochemie behandelt die Verteilung von Antigenen mithilfe der Spezifität von
Antikörpern. Diese Antikörper müssen jedoch ihrerseits lokalisiert werden. Dabei ist die
Avidin-Biotin-Methode eine bevorzugte Variante, um Antigene zu lokalisieren. Dazu wird
der primäre Antikörper mit einem sekundären Antikörper gekoppelt. Damit der sekundäre
Antikörper keine unspezifischen Bindungen eingeht, „blockt“ man diesen, indem er mit
Biotin markiert wird. Biotin wiederum geht einen Komplex mit Streptavidin ein, dass an einer
zweiten Untereinheit ein Markermolekül, z.B. Meerrettichperoxidase (HRP), besitzt.